Kultur jaringan tanaman terdiri dari molekul DNA kloning untuk tujuan tertentu. Kultur jaringan dapat memberikan strain DNA baru atau disajikan sebagai sampel untuk tujuan penelitian. Juga dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan, langkah-langkah yang terlibat memerlukan lingkungan sel inang bahan vektor pertumbuhan dan sarana untuk mengidentifikasi klon yang dihasilkan dari proses tersebut.
Bioteknologi menggunakan kultur jaringan untuk menumbuhkan baris sel, meningkatkan produksi tanaman tertentu, dan melakukan penelitian medis tentang penyakit. Dalam rangka kultur atau tumbuh, sel-sel dari sampel jaringan, dokter dan ahli bioteknologi harus mengumpulkan sel dari jaringan yang ada. Hal ini dilakukan melalui proses pengumpulan invasif yang dapat melibatkan pengeluaran sepotong jaringan melalui pemotongan, atau swabbing.
Sejarah
Tanaman memiliki kekuatan regeneratif yang luar biasa, terbukti dengan relatif mudahnya dimana mereka dapat berakar, transplantasi dan dicangkokkan. Upaya awal pada tanaman yang tumbuh in vitro dari bagian terpencil tidak berhasil, karena pengetahuan tentang nutrisi tanaman dan fisiologi tidak memadai. Dengan ditemukannya hormon tanaman penting, beberapa kemajuan telah dibuat mulai tahun 1920-an dan 30-an.
Sebuah kemajuan besar dibuat oleh Philip R. Putih pada tahun 1939 bersama laporannya kultur berkelanjutan wortel dan tembakau dilakukan sepenuhnya secara in vitro. Kemajuan lebih lanjut dibuat oleh Folke Skoog, yang menemukan sifat baru dan penting dari hormon auksin. Skoog, bersama dengan Toshio Murashige, melanjutkan untuk mengembangkan masih banyak digunakan standar larutan nutrisi tanaman — Murashige Skoog-(MS) media.
Pekerjaan dimulai oleh Kenneth Vivian Thimann di akhir 1950-an, yang menunjukkan bahwa kinetin mematahkan dormansi tunas lateral, yang memungkinkan mereka untuk berkembang seolah-olah mereka berada di ujung tanaman, membuka jalan bagi kemajuan cepat. Sejak saat itu, hasil baru dan penting diumumkan hampir setiap tahun. Saat ini hampir semua pohon bisa ditanam di bawah kontrol laboratorium dari awal serangkaian jaringan.
Kultur dari sel-sel yang dikumpulkan dapat terjadi dalam tabung reaksi, yang umumnya dikenal sebagai in-vitro, wadah budaya bulat, atau inkubator. Setelah menempatkan spesimen jaringan dalam lingkungan yang sesuai, cairan ditambahkan yang memberi makan sel kultur, dan mendorong pertumbuhan. Kultur tersebut kemudian dimonitor untuk perubahan dan pertumbuhan, sampai siap untuk digunakan.
Isolasi gen
Langkah-langkah dalam teknik kultur jaringan tanaman berusaha untuk mengidentifikasi bagaimana gen tertentu dalam untai DNA mempengaruhi proses pembangunan sel dengan bagian kloning dari untai DNA. Para ilmuwan juga dapat menggunakan teknik ini untuk mengkombinasikan bahan DNA dari dua organisme yang berbeda untuk menciptakan strain hibrida kode genetik. Dalam rangka menciptakan kultur jaringan, para ilmuwan harus terlebih dahulu mengisolasi gene atau gen tertentu dari satu atau lebih untai DNA. Menggunakan bahan kimia khusus yang disebut enzim restriksi, mereka dapat memotong untai di lokasi yang tepat yang sesuai dengan segmen gen tertentu. Ketika menggabungkan antara dua segmen yang berbeda bersama-sama, para ilmuwan menerapkan materi enzim lain yang menyekat ujung dari dua segmen berbeda secara bersama-sama.
Transfer Vektor
Proses kloning DNA membutuhkan vektor, atau agen pertumbuhan, untuk merangsang kegiatan pembelahan sel dalam kultur jaringan. Setelah para ilmuwan mengisolasi fragmen gen tertentu dari untai DNA-nya, mereka menyisipkan atau memasangkan ke agen pertumbuhan vektor. Organisme seperti bakteri atau virus dapat berfungsi sebagai vektor karena kemampuan alami mereka untuk terlibat dalam proses pembelahan sel. Metode transfer menggunakan bagian plasmid dari bakteri atau bahan DNA virus, yang hanya cincin kecil dari kode DNAI. llmuwan dapat menggabungkan sampel DNA dan segmen plasmid menggunakan bahan enzim, yang merupakan proses yang sama digunakan untuk menghubungkan dua segmen DNA yang berbeda bersama-sama. Begitu mereka telah bergabung dengan segmen DNA dan vektor, ilmuwan menanamkan mereka di dalam sel bakteri lain yang bertindak sebagai organisme inang.
Proses kloning
Hasil kultur jaringan tanaman terdiri dari segmen DNA kloning sebenarnya, yang dapat berkembang biak pada tingkat yang cepat tergantung pada jenis zat vektor digunakan. Langkah berikutnya dalam proses ini membutuhkan ilmuwan untuk mengidentifikasi bagian-bagian dari kultur jaringan yang dikembangkan sebagai hasil dari sampel DNA. Ketika kode DNA menggunakan kode RNA yang sesuai untuk melakukan kegiatan pembangunan sel yang sebenarnya, para ilmuwan menggunakan fragmen kode RNA untuk melokalisasi kode DNA dalam kultur jaringan. Dengan menerapkan lapisan radioaktif ke fragmen RNA, para ilmuwan dapat mengidentifikasi bagian DNA kloning berdasarkan bagaimana fragmen RNA mengikat daerah yang berbeda dalam kultur jaringan.
Tahapan Kultur Jaringan
Tahapan yang dilakukan dalam perbanyakan tanaman dengan teknik kultur jaringan adalah : Pembuatan media, Intisiasi, Sterilisasi, Multipikasi, Pengakaran, dan Aklimatisasi
1. Media
Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media yang di gunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan hormon. Selain itu di perlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, dan lain-lain. Zat pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenisnya maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan. Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca. Media yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan autoklaf.
Ada dua penggolongan media tumbuh : media padat dan media cair. Media padat umumnya berupa padatan gel, seperti agar, dimana nutrisi dicampurkan pada agar. Media cair adalah nutrisi yang dilarutkan di air. Media cair dapat bersifat tenang atau dalam kondisi selalu bergerak, tergantung kebutuhan.
2. Intisiasi
Intisiasi adalah pengambilan eksplan dari bagian tanaman yang akan dikulturkan. Bagian tanaman yang sering digunakan untuk kegiatan kultur jaringan adalah tunas.
Ada beberapa tipe jaringan yang di gunakan sebagai eksplan dalam pengerjaan kultur jaringan. Pertama adalah jaringan muda yang belum mengalami diferensiasi dan masih aktif membelah (meristematik) sehingga memiliki kemampuan regenerasi yang tinggi. Jaringan tipe pertama ini bisa ditemukan pada tunas apikal, tunas aksiler, bagian tepi daun, ujung akar, maupun kambium batang. Tipe jaringan kedua adalah jaringan parenkima, yaitu jaringan penyusun tanaman muda yang sudah mengalami diferensiasi dan menjalankan fungsinya. Contoh jaringan tersebut adalah jaringan daun yang sudah berfotosistesis dan jaringan batang atau akar yang berfungsi sebagai tempat cadangan makanan.
3. Sterilisasi
Sterilisasi adalah bahwa segala kegiatan dalam kultur jaringan harus dilakukan di tempat yang steril, yaitu dilaminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril. Sterilisasi juga dilakukan terhadap peralatan, yaitu menggunakan etanol yang disemprotkan secara merata pada peralatan yang digunakan. Teknisi yang melakukan kultur jaringan juga harus steril.
4. Multiplikasi
Multiplikasi adalah kegiatan memperbanyak calon tanaman dengan menanam eksplan pada media. Kegiatan ini dilakukan di laminar flow untuk menghindari adanya kontaminasi yang menyebabkan gagalnya pertumbuhan eksplan. Tabung reaksi yang telah ditanami eksplan diletakkan pada rak-rak dan ditempatkan di tempat yang steril dengan suhu kamar.
5. Pengakaran
Pengakaran adalah fase dimana eksplan akan menunjukan adanya pertumbuhan akar yang menandai bahwa proses kultur jaringan yang dilakukan mulai berjalan dengan baik. Pengamatan dilakukan setiap hari untuk melihat pertumbuhan dan perkembangan akar serta untuk melihat adanya kontaminasi oleh bakteri ataupun jamur. Eksplan yang terkontaminasi akan menunjukan gejala seperti berwarna putih atau biru (disebabkan oleh jamur) atau busuk (disebabkan bakteri).
6. Aklimatisasi
Aklimatisasi adalah kegiatan memindahkan eksplan keluar dari ruangan aseptic ke bedeng. Pemindahan dilakukan secara hati-hati dan bertahap, yaitu dengan memberikan sungkup. Sungkup digunakan untuk melindungi bibit dari udara luar dan serangan hama penyakit karena bibit hasil kultur jaringan sangat rentan terhadap serangan hama penyakit dan udara luar. Setelah bibit mampu beradaptasi dengan lingkungan barunya maka secara bertahap sungkup dilepaskan dan pemeliharaan bibit dilakukan dengan cara yang sama dengan pemeliharaan bibit generatif.
Lokasi laboratorium
Persyaratan lokasi laboratorium kultur jaringan hendaknya jauh dari sumber polusi, dekat dengan sumber tenaga listrik dan air. Untuk menghemat tenaga listrik, ada baiknya bila laboratorium kultur jaringan ditempatkan di daerah yang tinggi, agar suhu ruangan tetap rendah.
Kapasitas laboratorium
Ukuran laboratorium tergantung pada jumlah bibit tergantung pada jumlah bibit yang akan diproduksi. Untuk ukuran laboratorium sekitar 250 m2, bibit yang dapat diproduksi tiap tahun sekitar 400-500.000 planlet/bibit, yang dapat memenuhi pertanaman seluas 500-800 ha. Dalam suatu laboratorium minimal terdapat 5 ruangan terpisah, yaitu gudang (ruang) untuk penyimpanan bahan, ruang pembuatan media, ruang tanam, ruang inkubasi (untuk pertunasan dan pembentukan planlet/bibit tanama) dan rumah kaca.
